16號線起自六環外北安河，在北清路西端設置北安河站，之後沿北清路自西向東，在溫陽路路口設置溫陽路站，在稻香湖路路口設置稻香湖路站，在屯佃村北側設置屯佃站，溫陽路站、稻香湖路站以及屯佃站主要服務於中關村創新園和環保園。
線路在永豐產業基地設置永豐站。之後線路轉入永豐路，在永豐產業基地南設置永豐南站，在西北旺設置西北旺站。線路過西北旺後轉入圓明園西路，分別在馬連窪北路設置馬連窪站，在農大南路設置肖家河站。線路過五環路肖家河橋後至西苑，在西苑交通樞紐設置西苑站，線路出西苑站後沿萬泉河高架橋的西側向南，自西苑醫院壹角穿過，之後下穿海澱公園，向東轉入北四環。線路在萬泉河橋設置萬泉河橋站，之後沿北四環向東，在海澱橋線路向南轉入蘇州街，沿著蘇州街南下，線路沿蘇州街向南在蘇州街與海澱南路路口設置蘇州街站。
由蘇州街站向南，至西三環路蘇州橋設蘇州橋站；沿西三環路壹直向南，在萬壽寺處八壹劇場門前設萬壽寺站；之後線路轉向東，下穿紫竹院公園至國家圖書館站。之後下穿動物園及西直門外大街至三裏河路，沿三裏河路向南，在與車公莊大街交匯處設二裏溝站，在與阜成門外大街交匯處設甘家口站，在玉淵潭東門設玉淵潭東門站，在木樨地橋設木樨地站。線路下穿木樨地橋及永定河引水渠，進入三裏河南延路，線路下穿北京地下直徑線，在廣安門外大街設達官營站。
線路沿蓮花河西側路至紅蓮南路設紅蓮南裏站；之後轉入駱駝灣西路進入麗澤商務區的核心區設置麗澤商務區站，之後折向西在三環路西側，三環新城的東北角設豐益橋南站，沿鐵路向西進入豐臺火車站。過豐臺火車站後線路轉入萬壽路南延，與9號線並行1.1千米，在9號線豐臺南路站的東側設站；在豐臺公園處轉入富豐路，在富豐橋下設站，沿富豐路向西設置看丹站。之後向西北進入榆樹莊，再往西偏北，在抗戰雕塑園西側、五環路東側設置終點站宛平城站。