故事發生在2004年，即《生化危機2》六年後，由於各新聞媒體爭相報導Umbrella公司在萊肯市的地下研究所，制作的T-病毒早前泄漏導致陷入生化的危機。連串的負面新聞導致公司股票價格筆直暴跌。美國聯邦政府在各國政府的壓力下暫停安布雷拉公司的業務，其後公司便宣告破產，所有地下研究中斷，T-病毒的傳播得以停止。 這次的主角是在《生化危機2》中到萊肯市的警察，現在為美國總統直接統率的最高機密組織成員的裏昂·斯科特·肯尼迪。裏昂今次被派遣到歐洲某個（推測為西班牙或蘇格蘭）神秘村莊，受命拯救格林漢姆總統被拐去的女兒阿什莉·格林漢姆（Ashley Graham）。在拯救的途中他發現阿什莉的綁架者是壹個神秘的宗教團體，名叫“Los Illuminados”（西班牙語：照亮的道路。勿與Illuminati混淆），教主是奧斯穆德·薩德勒（Osmund Saddler）。 進入村莊後在村莊的房間救出了壹個神秘男子路易斯·賽拉（Luis Sera），就是這個時候村長比特羅斯·門德斯（Bitores Mendes）出現，裏昂跟村長交手可謂不堪壹擊，裏昂及路易斯都被擊暈了。同時，奧斯穆德出現，並且在裏昂身上註射了寄生體“Las Plagas”。裏昂醒過來的時候在山谷的另壹邊，從路易斯口中得知阿什莉正在被關在村內的教堂 他跟路易斯避開村民的襲擊後，路易斯便獨自逃去。裏昂回到村莊的教堂救出了阿什莉，並且利用強大武器擊倒了村長，於是離開神秘村莊，壹心等待美國聯邦政府派來的直升機，但是大量村民趕到，於是裏昂帶著阿什莉進了壹座古堡。 裏昂跟阿什莉遇上了堡主雷蒙·薩拉查（Ramon Salazar），堡主在地下礦場利用村民發掘寄生體Las Plagas並且供給Los Illuminados。在這期間，路易斯找到了能夠協助裏昂及阿什莉解開身上的寄生體的藥物及寄生體樣本，原來他曾經是Los Illuminados的研究員，然而奧斯穆德·薩德勒卻在關鍵時刻出現奪走了樣本，並把路易斯殺害。其後裏昂重遇了艾達·王，他在《生化危機2》後已經得知艾達是威斯克（Albert Wesker）派來的間諜，所以他對艾達的再次出現充滿懷疑，但被艾達逃去。裏昂始終很關心這個埋藏在心中的女子。艾什莉被薩拉查捉了及送到遙遠的有軍事設施後，裏昂擊倒了薩拉查後再次遇上艾達，艾達詢問英俊的裏昂需不需要送他壹程，裏昂以尷尬的表情回答。 裏昂在人工島上重遇據報在兩年前直升機失事死亡的戰友傑克·克勞薩（Jack Krauser）。原本他是安布雷拉公司的威斯克派了來到這裏做臥底 裏昂成功搶救了艾什莉並且逃脫。但是，艾達成功奪取了Las Plagas樣品，可能使安布雷拉公司勢力再起。
BOSS信息：
普通敵人 1. 寄生蟲（Las Plagas），遊戲裏所有的敵人體內都有，具有適應任何宿主並在其體內制造***生環境以及控制宿主的能力，有社會性，可以互相交流；進化出了類似螞蟻和蜜蜂的具有不同功能的個體。 2. 普通的被寄生蟲寄生的人形敵人（村民，雇傭兵，教徒等等，狗是特例），統稱Los Ganados。電鋸村民，鐵爪男，機槍男等只是生命力更頑強和武器更猛。 3. 隱形蟲，統稱Novistadors。 4. 再生者（Regenerator）。帶刺的再生者被歐美玩家形容為Iron Maiden（鐵處女，中世紀人形的裏面全是鐵釘的刑具。） BOSS 1. 湖怪（Del Lago） 2. 巨人（El Gigante） 3. 村長（Bitores Mendez） 4. 右手蛾摩拉（Gormorrah）城主是如此稱呼這位忠心的侍從的。可逃 5. 城主(Ramon Salazar）左手所多瑪(Sodom )合體（Sr. Ramon Salazar）必殺 6. 3個吊箱那裏的蟲子（U3）必殺 7. 克勞薩（Jack Krauser），唯壹在所有模式出場的BOSS級人物。未死 8.薩德勒（ Lord Saddler），全名Osmund Saddler必殺 附：敵人血量（壹般難度） 村民：4到14點 電鋸人：40點、50到60點 喪失犬：9點 湖之主：大約55到88點 巨人（1、2）：40（身）20（寄）點 村長：100（裂）60（半身）點 教徒:12到16點 紅衣主教（凡）：大約36點 紅衣主教（畫廊）：78點 紅衣主教（電梯）：26點 頭盔教徒：68（頭）15（身）點 瞎子鐵爪：36（背）230（身）點 隱身蟲：21到33點 白銀鎧甲兵：57（身+寄）點 黑鎧甲兵：62（身+寄）點 右手：900 （原）280（凍後）點 巨人（3、4）：150（身）80（寄）點 城主：16（觸）16（頭）230（身） 點 軍人：17到21點 面罩電棒：24點 蜘蛛寄生獸：4點 巨漢：18（頭）90（身) 點 機槍男：130點 U3：40（逃）308（身） 點 再生者：180到240點 再生者（刺）：280點 克勞薩：65（逃）260（身） 點 薩德勒：130（眼）150（滅眼）點