1991年,17歲的蔡少芬參加香港小姐競選獲得季軍,後與香港電視廣播有限公司簽約而出道。1993年因主演古裝劇《魔刀俠情》而走紅;1994年出演古裝電影《九品芝麻官之白面包青天》獲得關註,1995年出演周星馳的經典無厘頭電影《大話西遊之月光寶盒》。1998年憑借《妙手仁心》榮獲萬千星輝頒獎典禮最佳女主角。2000年與宣萱、陳慧珊、郭可盈被稱為為TVB“四大花旦”。
2002年主演歷史劇《洛神》;2004年因主演古裝神話劇《水月洞天》系列和《神鬼八陣圖》而走紅中國內地;2008年憑借《珠光寶氣》入圍第十五屆上海白玉蘭獎最佳女主角獎;2011年因出演宮鬥劇《甄嬛傳》中皇後壹角再攀演藝高峰。
蔡少芬2008年與內地演員張晉結婚,並於2011年和2013年生下兩個女兒。2014年3月25日,蔡少芬獲得電視世界英藝獎。
1992年蔡少芬出演第壹部電視劇《極度空靈》正式開始演藝之路。
1993年蔡少芬與溫兆倫等主演的古裝劇《魔刀俠情》播出,這是蔡少芬首次擔任女主角;1994年蔡少芬出演梁羽生經典小說《白發魔女傳》同名電視劇,飾演女壹號練霓裳 ;3月份,蔡少芬與周星馳、吳孟達、徐錦江等主演的古裝喜劇電影《九品芝麻官之白面包青天》上映,蔡少芬飾演青樓女子如煙 。
1995年蔡少芬與周星馳、朱茵、莫文蔚等主演的電影《大話西遊》上映,在香港票房不佳,但8月在上海上 映,後又在東北三省上映,票房高漲,除了1997年、1998年間的VCD熱賣以外,還有電影頻道的播出,《月光寶盒》和《大聖娶親》在電視上播出並重播過多次,而這部安排在非黃金時間播出的影片卻創下了黃金時間播出的收視率,蔡少芬在片中飾演鐵扇公主。
1997年蔡少芬與陶大宇、歐陽震華、宣萱、吳啟華等主演的電視劇《壹號皇庭V》播出,蔡少芬飾演李彤[7] ;1998年蔡少芬與羅嘉良、陳錦鴻主演的時裝劇《天地豪情》以及和吳啟華、林保怡等主演的時裝醫務劇《妙手仁心》播出,蔡少芬分別飾演孫樺和唐姿禮,並憑借《妙手仁心》獲得萬千星輝頒獎典禮最佳女主角獎。
1999年蔡少芬出演香港無線電視臺為慶祝香港回歸制作的百集長劇《創世紀》,蔡少芬飾演田寧 ;2001年蔡少芬出演《陀槍師姐III》,飾演女壹號衛英姿[ 。
2002年,蔡少芬與馬浚偉、郭羨妮主演的27集古裝歷史電視劇《洛神》,蔡少芬飾演傳奇女子甄宓:溫順如蒲草,堅定如磐石。] 2003年蔡少芬與於波、陳法蓉、張晉等主演的中國內地古裝神話劇《水月洞天》播出,該 劇在廣東、中國臺灣等多地都創下了很高的收視率,蔡少芬飾演的豆豆是壹個精於偷盜的江湖女賊。
2004年,蔡少芬出演《水月洞天》續集《靈鏡傳奇》和《陀槍師姐》續集《陀槍師姐Ⅳ》;2005年蔡少芬與焦恩俊主演的古龍小說《英雄無淚》改編而成的古裝電視劇《淚痕劍》,蔡少芬飾演擁有傾城的美貌和精湛的舞技的蝶舞 ;在與於波、周海媚主演的古裝魔幻神話劇《神鬼八陣圖》中飾演女壹號千尋 。
2006年蔡少芬與趙文卓、李小冉主演的梁羽生武俠小說改編的中國大陸古裝武俠劇《七劍下天山》以及和陳豪、黎姿主演的中國香港電視劇《火舞黃沙》播出,蔡少芬分別飾演飛紅巾和焦玉。[19-20] 2008年蔡少芬與邵美琪、黎姿等主演的都市情感劇《珠光寶氣》播出,蔡少芬飾演奸角康雅思,並憑借該劇再度入圍TVB萬千星輝頒獎典禮最佳女主角獎和第十五屆上海白玉蘭獎最佳女主角獎。
2011年11月蔡少芬和孫儷、蔣欣、劉雪華、陳建斌等主演的中國內地古裝宮廷劇《甄嬛傳》播出,該劇於2012年3月份在安徽衛視、上海東方衛視播出後連續壹個月獲得收視前兩位,大結局在安徽衛視收視率達到2.316%,蔡少芬飾演奸角皇後烏拉那拉·宜修。[24-25]
2012年,蔡少芬再度出演宮廷劇《美人無淚》和《金枝欲孽2》,分別飾演博爾濟吉特·哲哲和布雅穆齊·湘菱。2013年,蔡少芬在章子怡、王力宏、林心如主演的愛情電影《非常幸運》中飾演毒舌腹黑女西西。